John Harbo ha conseguito un dottorato di ricerca in Entomologia presso la Cornell University e lavora con le api mellifere dal 1967. Come ricercatore, ha sviluppato attrezzature e tecniche per l’inseminazione artificiale e la conservazione del germoplasma, ha sviluppato tecniche per l’allevamento selettivo delle api e ha prodotto le prime api mellifere resistenti alla varroa (1995). Nel 2001, il tratto di resistenza alla varroa (chiamato SMR, successivamente ribattezzato VSH) è stato rilasciato all’industria apistica. Dopo il suo pensionamento nel 2005, lui e Carol hanno fondato la Harbo Bee Company e hanno continuato il lavoro di allevamento di api resistenti agli acari.

Fonte: https://resistantbees.com/blog/?page_id=1659https://resistantbees.com/blog/?page_id=1659

Journal of Apicultural Research and Bee World 48(3): 156-161 (2009) © IBRA 2009
DOI 10.3896/IBRA.1.48.3.02

ARTICOLO DI RICERCA ORIGINALE

Risposte alla Varroa da parte delle api mellifere con diversi livelli di igiene sensibile alla Varroa

John R. Harbo1 e Jeffrey W. Harris1*

1USDA/ARS Honey Bee Breeding, Genetics and Physiology Lab., Baton Rouge, Louisiana 70820 USA.
Ricevuto il 6 gennaio 2008, accettato con riserva di revisione il 14 maggio 2008, accettato per la pubblicazione il 17 agosto 2008.
*Autore corrispondente: Jeffrey Harris

Riepilogo

La resistenza agli acari, che in precedenza avevamo chiamato soppressione della riproduzione degli acari (SMR), è una forma di comportamento igienico che abbiamo chiamato Igiene Sensibile alla Varroa (VSH). Con la VSH, le api operaie adulte (Apis mellifera) interrompono la riproduzione degli acari parassiti (Varroa destructor) rimuovendo le pupe infestate dagli acari dalle loro celle. Questo studio determina quali celle di covata sono prese di mira dalle api con VSH e quali no, e descrive la relazione tra la rimozione della covata e l’improvvisa prevalenza di acari sterili. Abbiamo prodotto 26 colonie con diversi livelli di VSH reincrociando 14 regine di una linea alta, H (100% di espressione di VSH) e 12 regine di una linea bassa, L (nessuna VSH), con fuchi prodotti da una regina HL (alta × bassa). Poiché ciascuna delle 26 regine era accoppiata con un fuco, ci si aspettava che le colonie risultanti rappresentassero l’intervallo completo di variabilità (dallo 0 al 100% degli alleli per VSH). Per stimare la rimozione della covata, abbiamo misurato le popolazioni di acari nella covata di operaie opercolate 0-3 giorni dopo l’opercolatura e di nuovo 7 giorni dopo, quando la coorte aveva un’età compresa tra 7 e 10 giorni dopo l’opercolatura. Abbiamo correlato la rimozione della covata infestata da acari con la presenza relativa (a 7-10 giorni dopo l’opercolatura) di tre classi di acari fondatori: (1) vitali: quelli con almeno una figlia in grado di maturare prima dell’emergenza dell’ape ospite; (2) non vitali: quelli con progenie ma senza figlie in grado di raggiungere la maturità; e (3) senza uova: quelli con acari fondatori morti o non depositanti. Con l’aumento del tasso di rimozione, entrambe le classi 1 e 2 hanno mostrato cali significativi, mentre la classe 3 è rimasta invariata. Pertanto, l’ovideposizione dell’acaro o qualcosa ad essa associato fornisce lo stimolo alle api con il tratto VSH per rimuovere le pupe infestate dall’acaro.

Introduzione

Abbiamo selezionato api mellifere per la resistenza a Varroa destructor Anderson e Trueman. Grazie all’uso di inseminazioni con fuchi singoli, abbiamo rapidamente riscontrato resistenza (quasi eliminazione della popolazione di acari). Abbiamo chiamato questa caratteristica “Riproduzione Soppressa degli Acari” (SMR), perché quando abbiamo esaminato pupe di api operaie 7-11 giorni dopo l’opercolatura, la maggior parte o tutti gli acari non avevano progenie vitale (Harbo e Harris, 1999). Studi hanno dimostrato che questa condizione era causata dalla rimozione della covata infestata da acari da parte di api adulte (Ibrahim e Spivak, 2004, 2006; Harbo e Harris, 2005). Questa rimozione delle pupe infestate da acari è apparentemente limitata alle pupe operaie e, sebbene le api possano talvolta rimuovere le pupe di fuchi infestate da acari, non riducono significativamente l’infestazione nella covata di fuchi (Harris, 2008). La rimozione delle pupe infestate da acari da parte di api adulte spiega perché la resistenza agli acari non è stata osservata fino a circa sei settimane dopo l’introduzione di una regina resistente agli acari, perché l’acaro è scomparso così improvvisamente e come le popolazioni di acari hanno potuto riprendersi nelle colonie in cui le regine resistenti sono state sostituite da regine suscettibili (Harbo e Harris, 1999; Harris e Harbo, 2000). Abbiamo quindi rinominato questo tratto di resistenza agli acari “Igiene Sensibile alla Varroa” o VSH perché sembra essere una forma di comportamento igienico. Il termine SMR, un tempo utile per descrivere il nostro lavoro di selezione, non descriveva accuratamente il comportamento delle api resistenti.
Le api mellifere a volte distruggono e rimuovono la loro covata in quello che a noi sembra essere un tentativo di eliminare malattie, parassiti o api morte dalle loro celle di covata. La rimozione delle pupe di api infestate da V. destructor può essere paragonabile alla rimozione della covata nelle celle infette dal batterio della peste americana (Woodrow e Holst, 1942; Rothenbuhler, 1964). Rothenbuhler descrisse questa rimozione della covata malata da parte delle api adulte come comportamento igienico, e il termine comportamento igienico è stato successivamente ampliato per includere la rimozione della covata uccisa dal congelamento (Newton et al., 1975), della covata uccisa dalla puntura (Spivak e Downey, 1998), della covata infestata da covata gessosa (Gilliam et al., 1983), della covata invasa dalla tignola della cera, Galleria mellonella (Corréa-Marques e De Jong, 1998; Villegas e Villa, 2006), o della covata infestata dal piccolo scarabeo dell’alveare, Aethina tumida (Ellis et al., 2003, 2004; Neumann e Härtel, 2004). Pertanto, l’igiene nelle api è giunta a significare l’individuazione e la rimozione della covata malata o morta da parte delle api adulte.

Questi diversi tipi di comportamento igienico presentano somiglianze, ma anche alcune differenze. Spivak e Reuter (2001) hanno scoperto che le colonie selezionate per la rapida rimozione della covata congelata erano più resistenti alla peste americana (AFB). Studi che hanno correlato alti e bassi livelli di igiene tra covata congelata e covata gessosa non hanno trovato strette correlazioni (Taber, 1986; Spivak e Gilliam, 1993), ma un gruppo di colonie selezionate per l’igiene congelata era complessivamente più resistente alla covata gessosa rispetto a un altro gruppo di colonie selezionate per scarsa igiene della covata congelata (Spivak e Gilliam, 1993; Spivak e Reuter, 2001). Analogamente, la VSH presenta alcune somiglianze con le altre forme di igiene, ma anche alcune differenze. Ad esempio, la VSH ha prodotto fenotipi intermedi che potrebbero essere meglio spiegati da alleli additivi (Harbo e Harris, 2005a), mentre il comportamento igienico responsabile della resistenza alla peste americana (Rothenbuhler, 1964) è risultato essere un carattere recessivo. La rimozione igienica della covata congelata sembra essere controllata dagli effetti quantitativi di molteplici geni (Lapidge et al., 2002).
Lo scopo di questo articolo è definire il carattere VSH nel modo più preciso possibile. La VSH presenta due elementi generali: la rimozione delle celle di covata infestate e un’elevata frequenza di acari non riproduttivi. In studi precedenti (Harbo e Hoopingarner, 1997) la prevalenza di acari non riproduttivi era fortemente correlata a popolazioni di acari ridotte, mentre l’igiene degli acari congelati non lo era. La prevalenza di acari non riproduttivi è stata quindi utilizzata come base per la nostra selezione. Non sappiamo se questa prevalenza sia una componente critica della resistenza agli acari, ma è una caratteristica che definisce la VSH. Una descrizione chiara della VSH dovrebbe consentire ad altri di: (1) riprodurre il tratto;

(2) descrivere varianti o componenti di VSH; e (3) riconoscere tratti di resistenza agli acari che sono parzialmente o totalmente indipendenti da VSH. Gli obiettivi specifici di questo studio erano: (1) definire quali infestazioni da acari sono prese di mira da VSH e quali no; (2) descrivere la relazione tra la rimozione della covata e la presenza relativa di acari non ovidepositari; e (3) descrivere le qualità di resistenza agli acari nelle colonie che hanno meno del 100% degli alleli per VSH.

Materiali e metodi

Abbiamo prodotto un gruppo di 26 colonie che rappresentassero tutti i livelli di espressione di VSH. Quattordici colonie avevano regine prodotte da una linea con espressione di VSH al 100% (linea alta, H) e 12 avevano regine prodotte da una linea che non esprimeva VSH (linea bassa, L). Ognuna delle 26 regine è stata retroincrociata con un singolo fuco prodotto da una regina HL (figlia di entrambe le linee H e L). Poiché gli spermatozoi di un fuco aploide sono tutti repliche genetiche dell’uovo aploide da cui il fuco si è sviluppato, i 26 fuchi rappresentano 26 gameti segregati casualmente da quella regina. I fuchi dovrebbero quindi avere dallo 0 al 100% degli alleli per VSH, e la probabilità prevede un numero uguale di fuchi con zero e 100%. Con questo schema, le colonie nel gruppo H dovrebbero avere dal 50 al 100% degli alleli per VSH e quelle nel gruppo L dovrebbero avere dallo 0 al 50%.

Le regine di prova sono state introdotte nelle colonie a luglio e all’inizio di agosto. Le colonie sono state valutate per la rimozione della covata dopo che le regine di prova avevano deposto le uova nelle loro colonie per almeno sei settimane. In questo modo, tutte le api operaie di età compresa tra 0 e 3 settimane sarebbero state figlie della regina di prova.

Popolazioni di acari nella covata appena opercolata

La misurazione della popolazione di acari nella covata appena opercolata è stato il nostro primo passo per stimare la rimozione della covata da parte delle api con VSH. Abbiamo campionato la covata operaia 0-3 giorni dopo l’opercolatura per stimare la popolazione di base di acari in ogni colonia. Abbiamo identificato la covata operaia 0-3 giorni dopo l’opercolatura esaminando solo la covata opercolata che non aveva ancora perso gli embrioni larvali. Poiché la maggior parte degli acari nel gruppo 0-3 giorni (infestazione iniziale) non aveva ancora iniziato a deporre le uova, questo campione poteva solo misurare il tasso di infestazione da acari. La stessa coorte di covata sarebbe stata campionata nuovamente sullo stesso favo sette giorni dopo per valutare la popolazione di acari e la storia riproduttiva degli acari rimanenti.

Se meno del 5% delle celle appena opercolate risultava infestato, la colonia veniva inoculata con ulteriori acari. Abbiamo inoculato i favi con gli acari rimuovendo un favo di covata da una colonia di prova e inserendolo in una colonia altamente infestata per tre giorni. Il favo doveva contenere larve non opercolate che sarebbero state opercolate (e quindi infestate dagli acari) nei tre giorni successivi. Abbiamo aumentato l’efficacia di una colonia donatrice di acari ingabbiando la regina circa due settimane prima di fornirle i favi delle colonie di prova. L’ingabbiamento si è rivelato utile perché: (1) la colonia donatrice non avrebbe avuto larve che potessero attirare gli acari lontano dalle celle bersaglio; (2) la colonia donatrice avrebbe avuto una percentuale maggiore di acari residenti su api adulte e quindi disponibili a invadere; e (3) la regina in gabbia non avrebbe contaminato il favo donatore deponendovi le uova (nel caso in cui avessimo voluto testare nuovamente le colonie in seguito). Dopo tre giorni, i favi inoculati sono stati rimossi dalle colonie di acari donatori, la popolazione di acari in quei favi è stata misurata esaminando 200 cellule che si trovavano da 0 a 3 giorni dopo la opercolatura e i favi sono stati rimessi nelle rispettive colonie di prova.

Misurazione della rimozione della covata

In questo articolo facciamo riferimento a una misurazione della rimozione della covata. Abbiamo misurato una variazione nella frequenza di covata infestata da acari e abbiamo ipotizzato che la scomparsa delle pupe infestate corrispondesse alla rimozione delle pupe di ape da parte di api adulte. Se qualcuno venisse a sapere che le pupe infestate sono scomparse per altri motivi, le nostre analisi rimarrebbero valide, ma i riferimenti alla rimozione dovrebbero essere modificati.
Per misurare la rimozione della covata, abbiamo campionato le popolazioni di acari una seconda volta quando le celle erano 7-10 giorni dopo l’opercolatura. Abbiamo identificato le pupe di questa età in base al loro colore: occhi viola e corpo bianco o pupe dal corpo marrone chiaro. Abbiamo misurato il tasso di infestazione delle celle, il numero di progenie e il livello di sviluppo della progenie. Abbiamo dovuto esaminare 428 ± 180 (media ± DS) celle per colonia per trovare una media di 20 ± 8 celle infestate da ciascuna delle 26 colonie. Un campione era composto da circa 200 cellule (di più per il secondo campione, come spiegato sopra). Per ogni campione è stato contato il numero di cellule infestate e il numero di cellule non infestate. Abbiamo utilizzato le cellule non infestate come parametro di riferimento e abbiamo prodotto un termine di infestazione per ciascun campione (numero di cellule infestate per 100 cellule non infestate).

Ipotesi testate

Il nostro obiettivo primario era determinare quali, se presenti, cellule infestate dagli acari fossero state colpite da VSH. Abbiamo ipotizzato quattro possibilità:
(1) le api trattate rimuovevano le pupe in modo casuale; (2) le api rimuovevano tutte le pupe infestate in modo uniforme; (3) le api rimuovevano solo le pupe infestate dagli acari che contenevano almeno una figlia vitale (una che potesse raggiungere la maturità prima dell’emergenza dell’ape ospite); oppure (4) le api rimuovevano tutte le pupe con acari che depongono uova.

La prima ipotesi è stata affrontata confrontando la rimozione degli acari in tutte le colonie utilizzando l’Analisi della Varianza (SAS 2000). L’analisi ha confrontato le colonie H e L per determinare se la rimozione delle cellule infestate fosse diversa nei due gruppi e se ciascun gruppo fosse significativamente diverso da zero. Per correggere la non normalità dei dati di rapporto, ciascuna percentuale di rimozione è stata trasformata in log10 del tasso di rimozione + 1. Analisi di regressione sono state utilizzate per valutare le ipotesi 2-4. Valutando la sopravvivenza degli acari di ciascuna delle tre classi riproduttive (acari con prole vitale, acari con prole non vitale e acari che non depongono uova), abbiamo potuto determinare se la sopravvivenza di ciascuna classe fosse influenzata da variazioni nel tasso di rimozione delle cellule infestate.

L’analisi di regressione è stata utilizzata anche per misurare la correlazione tra il tasso di rimozione delle pupe infestate da acari e la prevalenza di acari sterili e morti. Abbiamo misurato la frequenza di acari sterili e morti (acari non ovidepositatori) dividendo il numero di pupe con acari ovidepositatori per il numero di acari non ovidepositatori. Abbiamo chiamato questa misura il rapporto di ovideposizione degli acari (OVR) e può essere misurata solo >7 giorni dopo l’opercolatura. Una tipica colonia suscettibile avrà un OVR di 6 (6 pupe con acari riproduttori per ogni pupa infestata senza ovideposizione degli acari). Le colonie resistenti agli acari hanno un OVR compreso tra 0 e 1,5.
Risposta alla Varroa da parte delle api con VSH159

Fig. 1 Storia riproduttiva degli acari sopravvissuti alla rimozione igienica. In ogni colonia, ogni cella infestata da acari sopravvissuta è stata suddivisa in una delle tre classi riproduttive. Senza rimozione degli acari, la somma delle 3 classi riproduttive (la somma delle colonne in ciascun gruppo) sarebbe pari al 100%. Il punto medio del primo gruppo (0-19%) è il 10% di rimozione, quindi la somma delle colonne è il 90%. Il punto medio dell’ultimo gruppo (80-99%) è il 90% di rimozione, quindi la somma delle colonne è il 10% (il 90% delle celle infestate in quel gruppo non è sopravvissuto). Questa figura mostra la relazione tra il tasso di rimozione della covata infestata da acari e la riproduzione degli acari nella covata sopravvissuta. Due classi di riproduzione degli acari (progenie vitale e progenie non vitale) sono diminuite all’aumentare del tasso di rimozione, ma non si è verificato alcun cambiamento nella sopravvivenza delle celle con acari che non hanno deposto uova. Ogni set di colonne rappresenta la media di un gruppo di colonie i cui tassi di rimozione rientravano in quell’intervallo. 8 colonie rientravano nell’intervallo 0-19%, nessuna nell’intervallo 20-39% e rispettivamente 5, 7 e 6 colonie negli intervalli più alti. Le analisi statistiche presentate nel testo hanno utilizzato il tasso di rimozione esatto per ciascuna colonia anziché i dati raggruppati.

Risultati

Le api con il tratto VSH hanno rimosso preferenzialmente le pupe infestate dagli acari quando si sono trovate di fronte a covata di operaie opercolate infestate. In particolare, la covata nelle colonie H ha mostrato una significativa riduzione del numero di celle infestate (media ± SE = 78 ± 7%) (df = 24, t = 10,5, P < 0,0001). La rimozione casuale delle pupe non avrebbe comportato alcuna variazione nel tasso di infestazione. Pertanto, l’ipotesi 1 è stata respinta. Anche le colonie del gruppo L hanno mostrato una perdita complessiva di celle infestate (16 ± 7%), ma non significativamente diversa da zero (df = 24, t = 1,85, P = 0,08). Le medie dei due gruppi erano significativamente diverse (df = 1, 24; F = 33,7; P < 0,0001).

L’ipotesi 3 è stata respinta perché la sopravvivenza delle due classi di acari depositari di uova è diminuita significativamente con l’aumentare della rimozione delle celle infestate dagli acari (Fig. 1). La relazione tra la rimozione della covata e la sopravvivenza della classe vitale di acari era y = -0,62x + 56 dove y = percentuale di sopravvivenza della classe vitale di acari e x = percentuale di rimozione delle pupe infestate (F = 196,0; df = 1, 24; P < 0,0001). La relazione era simile per la classe non vitale di acari depositari di uova, y = -0,21x + 20 (F = 42,6; df = 1, 24; P < 0,0001).

L’ipotesi 2 è stata respinta e l’ipotesi 4 è stata accettata perché la classe senza uova ha prodotto una pendenza non diversa da zero, y = -0,05x + 15 (F = 2,2; df = 1, 24; P < 0,15), e quindi non ha mostrato alcun segno di rimozione. Le costanti (56, 20 e 15%) in queste equazioni stimano la presenza relativa di queste tre classi di acari nelle colonie che non rimuovono le pupe infestate dagli acari (Fig. 1).

La relazione tra la rimozione della covata e il rapporto di deposizione delle uova degli acari

È stata riscontrata una forte relazione lineare tra la percentuale di rimozione delle pupe infestate da acari (x) e il rapporto di deposizione delle uova (y) (y = -0,057x + 5,8) (F = 27; df = 1, 24; P < 0,0001; R2 = 0,52). Supponendo che l’ipotesi 4 sia corretta e che il 15% degli acari in tutte le colonie non deporrebbe le uova in assenza di rimozione della covata, la nostra relazione prevista sarebbe y = -0,067x + 5,7. La costante o intercetta zero è il rapporto acari-ovideposizione (OVR) (85/15) quando la rimozione (x) = 0. Quando x = 85 (tutti gli acari che depongono le uova vengono rimossi), l’OVR dovrebbe essere uguale a zero (0/qualsiasi numero > 0). Pertanto, la pendenza prevista (b) = -0,067. Sia la pendenza che l’intercetta della linea prevista rientrano negli errori standard generati dai dati (gli errori standard per pendenza e intercetta sono rispettivamente ± 0,011 e ± 0,7). Poiché la relazione tra rimozione della covata e rapporto di ovideposizione degli acari è così stretta, concludiamo che il VSH può essere stimato misurando uno qualsiasi di essi.

Discussione

La rimozione delle pupe infestate e la mancata rimozione delle pupe con acari che non depongono uova sono gli elementi che definiscono la VSH. Come visto sopra, queste misure sono correlate nelle colonie con VSH. Tuttavia, potrebbero non esserlo quando si seleziona solo per la rimozione igienica degli acari. Per produrre entrambi gli elementi, potrebbe essere necessario basare l’allevamento selettivo sull’OVR. Fortunatamente, misurare il rapporto di deposizione degli acari è solitamente più facile che misurare la rimozione della covata (una misurazione anziché due) e forse più accurato (un errore di misurazione anziché due). Sfortunatamente, gli acari che non depongono uova e gli acari morti vengono facilmente trascurati quando si esaminano le pupe di api.
Quando si misura l’OVR (il numero di pupe con acari che depongono le uova / il numero di pupe con acari che non depongono le uova) è necessario solo determinare se una pupa infestata da acari (>7 giorni dopo l’opercolatura) abbia progenie. Non è necessario contare la progenie, determinare il numero di acari fondatori o determinare se la progenie possa raggiungere l’età adulta. Se una colonia non ha abbastanza acari per valutare la presenza di VSH, è possibile inserire nella colonia la covata operaia infestata e, sette giorni dopo la opercolatura, valutare le pupe di età compresa tra 7 e 10 giorni (vedere materiali e metodi).

La presenza di VSH è meglio selezionata da colonie con rapporti di ovideposizione degli acari pari o inferiori a 2. Le colonie con OVR > 3 forniscono misure inaffidabili della presenza di VSH poiché la variazione naturale può variare da 4 a 10 e forse anche inferiore. In questo studio, le 14 colonie del gruppo H presentavano rapporti di ovideposizione degli acari compresi tra 0 e 1,4. Il gruppo L variava da 3,3 a 9,5 e 8 delle 12 colonie non mostravano alcuna espressione misurabile di VSH sotto forma di rimozione di covata infestata o un basso OVR. Sembra quindi che le api con il 50-100% degli alleli VSH esprimano un livello significativo di resistenza agli acari, mentre quelle con lo 0-50% di solito non lo fanno. Questo spiega perché abbiamo prodotto un livello significativo di resistenza agli acari in colonie contenenti regine VSH che sono state accoppiate liberamente con fuchi non selezionati (Harbo e Harris, 2001).

Questo studio non ha esaminato il destino degli acari il cui ciclo riproduttivo è stato interrotto. La longevità e la successiva fertilità degli acari possono essere influenzate da questo tipo di interruzione, e in uno studio precedente abbiamo registrato un picco nella frequenza di acari intrappolati tra la parete cellulare e il bozzolo (Harris e Harbo, 2000). Ibrahim e Spivak (2006) hanno scoperto che gli acari prelevati da api con VSH (SMR) presentavano una maggiore frequenza di mancata deposizione delle uova rispetto agli acari prelevati da colonie di controllo. Pertanto, l’interruzione della fase riproduttiva di un acaro in una cella di covata (come prodotto da VSH) può contribuire al fallimento riproduttivo o alla morte dell’acaro se rientra nella cella di covata.

Se le api con VSH rimuovono solo le pupe dalle celle infestate da acari che depongono le uova, allora stanno rispondendo (direttamente o indirettamente) alle uova o agli acari che depongono le uova. Le risposte indirette, ad esempio, potrebbero essere api adulte che rilevano segnali chimici o comportamentali da un acaro che depone le uova, da acari immaturi o da pupe stressate (Boecking e Spivak, 1999; Boot et al., 1999; Aumeier e Rosenkranz, 2001; Martin et al., 2002; Vandame et al., 2002; Nazzi et al., 2004), o da cambiamenti nei profili cuticolari delle pupe ospiti (Salvy et al., 2001; Martin et al., 2002).
Harbo, Harris

Ringraziamenti

Daniel Winfrey e David Dodge (ARS-USDA, Baton Rouge) hanno fornito supporto tecnico. Deborah Boykin, statistica, ARS/USDA, Stoneville, Mississippi, ha fornito consulenza statistica. Il lavoro è stato svolto in collaborazione con la Louisiana Agricultural Experiment Station.

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